甲肝:免疫損傷
1.5.2 PT測定，自動凝血儀(比濁法)，直接報告PT(±s)，同時加做正常對照。
1.2 實驗動物及肝纖維化模型制作 健康Wister大鼠40只，5月齡，雌雄各半，體重214. 7±25g，北京醫(yī)科大學動物養(yǎng)殖中心提供。飼養(yǎng)觀察1周后用于實驗。按性別進行區(qū)組設計，隨機分為正常對照組、模型組（實驗對照組）、高劑量治療組、低劑量治療組，每組10只（雌雄各半）。除正常對照組外，每周給其他3組大鼠腹腔注射豬血清2次，每次0. 5ml/只，連續(xù)8周。制成肝纖維化模型。
模型組肝細胞腫脹，胞質內出現大量空泡，小葉內和小葉間、匯管區(qū)等間質細胞成分和纖維成分明顯增高，肝細胞核變形或稍固縮，細胞邊界不清楚，胞質不均勻或大空泡（圖2）。Mallory染色時，可見大量藍綠色粗大的膠原纖維束，呈放射狀插入肝小葉，將肝臟分割成以匯管區(qū)為中心的假小葉。經彩色圖象分析儀統(tǒng)計，可見肝內膠原纖維面密度明顯高與其他組（表3）。治療后大劑量組肝細胞內空泡減少，纖維成分減少；而小劑量組纖維成分較少不明顯（圖3、4）。
3 討論
2.2 肝功能改變
1.1.2 自動血凝儀及相關試劑，用于PT測定。
3.1 豬血清誘發(fā)大鼠免疫損傷性肝纖維化的機理，主要是血清引起機體產生可溶性免疫復合物，激活補體。由于肝細胞表面存在Fc受體，可與免疫復合物結合而沉積于細胞膜，導致肝細胞損傷并激發(fā)肝細胞、貯脂細胞和成纖維細胞增生，表現為Ⅲ型變態(tài)反應。本模型與臨床乙型肝炎病毒引起的慢性活動性肝炎和肝硬化與自身免疫應答及免疫調節(jié)功能紊亂有相似性，故對指導臨床研究有很重要價值。
1.6 形態(tài)學檢查 快速處死動物，肝臟多部位取材，液體石蠟包埋，制備冰凍切片，分別進行HE、Mallory和免疫組化染色，光學顯微鏡觀察肝小葉結構和膠原纖維密度，用網格計數器計數吞噬細胞和儲脂細胞密度。
2.3 形態(tài)學觀察(HE和Mallory染色) 正常組大鼠肝臟中以肝細胞為主，結締組織和間質細胞較少，因此肝小葉分界不明顯，肝小葉間匯管區(qū)可見小葉間A、V和膽管，其中結締組織和纖維成分較少；膠原纖維成分也很少。肝細胞為多邊形，邊界可見，胞質弱嗜酸性，均勻一致，胞核呈圓形，1～2個，嗜堿性（圖1）。
2.2.2 治療前后大鼠凝血酶原時間的變化（表2），各組均與模型組（實驗對照組）比較。表2 各組大鼠凝血酶原時間（PT）測定結果注：各組均與實驗對照組比較表2顯示：血漿凝血酶原時間（PT），實驗對照組較治療組明顯延長，差異極為顯著（P<0. 0005）。
3.3 祖國醫(yī)學著作（失血大法）闡述：“失血一癥，大抵由于肝不藏血，脾不統(tǒng)血”；繆仲醇《先醒齋醫(yī)學廣筆記·吐血篇》云“吐血者，肝失其職也”；近代周炳麟認為：“血癥之患，肝臟首當其沖”，可見肝、脾與血癥的密切關系。肝藏血功能指肝有貯存血液、調節(jié)血量和化生血液的作用。血漿蛋白不僅是構成血液的主要成分，并且對維持滲透壓、保持凝血-抗凝和纖溶的動態(tài)平衡起著重要的作用。肝不藏血之說雖不能等同于肝病出血，但包括在其范圍之內，各種致病因素損及肝臟，將會使肝藏血、化生血液成分的功能受到影響，表現為蛋白質合成減少和凝血、抗凝及纖溶障礙。從而導致出血或血栓形成。
2.1 一般狀況觀察 肝損傷大鼠在實驗初期毛發(fā)光亮、一般狀態(tài)良好。與正常對照組大鼠相比，飲食、飲水無異常變化，4～7周后，實驗組較對照組體重增長緩慢，8～11周治療期間體重增長較快，且大劑量組明顯優(yōu)于小劑量組。
圖6 陽性貯脂細胞胞質呈棕黃色S-MA免疫組化染色400×
凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ是由肝細胞合成的維生素K依賴性凝血因子。肝纖維化（硬化）時，在肝損傷尚未引起循環(huán)衰竭的情況下，大鼠PT延長，臨床表現為出血傾向。由于：①肝細胞損害時，蛋白質合成功能低下，維生素K吸收障礙，使維生素K依賴性凝血因子的前體不能轉化為有活性的凝血因子。導致凝血障礙。②肝病變時，由于肝細胞功能紊亂，合成肝素酶的功能降低，使肝臟對肝素或肝素類物質的滅活能力下降，血漿中肝素濃度增加，抗凝活性增強。③肝功能障礙引起凝血因子合成減少，最先影響FⅦ，其次是FⅡ，最后是FⅤ和FⅩ。相對于內源性凝血途徑和其他因子而言，FⅦ的生物半壽期最短（6～8h），因此在反映肝源性凝血障礙和功能恢復的檢測指標中，PT較為敏感。本研究高劑量治療組PT較正常對照組略低，但該差異無臨床意義（<3s）。
1.3 中藥組方：黃芪、蜈蚣、三七、山慈姑、郁金、枳實、白術。采用現代中藥制劑工藝，通過質量監(jiān)測、穩(wěn)定性實驗、衛(wèi)生學檢查等環(huán)節(jié)制成標準顆粒劑備用。臨時按劑量要求配成水溶液即可服用。
1.4 肝纖維化大鼠的藥物治療 分別給低劑量、高劑量治療組以制備好的中藥顆粒溶液灌胃，劑量分別為1g/1ml/100g體重、2g/1ml/100g體重；1次/d，共4周。
本研究在給模型組采血時發(fā)現，即使采血很順利，血液和抗凝劑及時徹底的混合，仍有2只大鼠采血后立即發(fā)生了凝血，可見少部分肝纖維化的大鼠已處于高凝狀態(tài)。血漿凝血酶原時間延長固然與FⅦ合成不足有關，但也不排除由于凝血因子的提前過度消耗而引起繼發(fā)性凝血障礙。
1.1.1 日立7150自動生化分析儀及相關試劑，測定血清ALT及A、G（A/G）。
吞噬細胞和儲脂細胞模型組顯著高于正常對照組（表4），治療后略有降低，高劑量組較低劑量組降低明顯（圖5、6）。表3 肝間質膠原纖維密度（Mallory染色）（面密度/μm2，x±s）注：*與正常組比較有顯著性差異P<0. 05;Δ與模型組比較有顯著性差異P<0. 05 表4 儲脂細胞和巨噬細胞計數（個/視野）（免疫組化染色）（±s)
3.4 中藥復方針對肝纖維化的病機特點（本虛標實），據治肝補脾原則組方，達益氣健脾、理血軟肝之功效。其作用機理為：①有效地保護肝細胞，減輕肝細胞變性壞死的程度。如：黃芪、白術可保護肝細胞，促進肝糖原合成；郁金（姜黃素）對肝細胞損害有抑制作用；山慈姑（秋水仙堿）有促進肝細胞再生，減少肝小葉變性壞死的作用。②有效地調節(jié)免疫功能。其中黃芪（黃芪多糖）、白術能增強機體免疫活性，對細胞免疫、體液免疫和非特異免疫均有調理作用。③有促凝和抗凝活性，控制出血、凝血傾向。三七有明顯的護肝作用，使肝細胞合成凝血因子和滅活肝素類物質的能力不至嚴重減低，糾正凝血時間和凝血酶原時間；白術有抗凝血作用，枳實可增加冠脈流量，減少血管阻力，改善肝臟微循環(huán)。④抑制膠原纖維增生，預防和延緩肝硬變的發(fā)生。山慈姑的主要成分為秋水仙堿，能抑制肝內儲脂細胞(結蛋白陽性細胞)的增殖和轉化，減少膠原合成及在肝竇周沉積［6］，從而減輕肝脾腫大，延緩肝硬變的發(fā)生。蜈蚣能解毒軟堅，組織切片觀察結果也證實了這一作用。因此，中藥復方在保護肝臟（恢復肝功能）、改善肝臟微循環(huán)、抗肝纖維化和改善出血傾向等方面起到明顯療效，是臨床有待開發(fā)應用的良方。
2 結果
1.5 給各組動物心臟采血，制備血清及枸櫞酸鈉（1:9）抗凝血漿用于以下測定。
1.1 儀器或試劑
1.5.1 ALT、A、G測定，自動生化分析儀預熱30min后,常規(guī)測定血清蛋白濃度g/L（±s），計算A/G。
肝纖維化在不同進展時期引起相應的形態(tài)及功能改變。中醫(yī)藥治療免疫損傷性肝纖維化有得天獨厚的優(yōu)勢，但在實驗研究及臨床報道中，不同醫(yī)家所報道的組方形式及觀察指標各有側重。本文就肝纖維化大鼠模型治療前后肝細胞功能及肝小葉組織的形態(tài)學變化對芪蚣抗纖方的療效進行全面評價。
1 材料與方法
3.2 反映肝細胞損傷最敏感的指標為轉氨酶，肝損傷急性期，轉氨酶明顯升高，疾病發(fā)展到慢性期則維持在略高的水平。此時蛋白質的變化更為明顯。血漿中的白蛋白主要在肝細胞內合成，肝纖維化（硬化）時，正常肝細胞數目減少，單核巨噬細胞增生，表現為血漿白蛋白降低，球蛋升高，A/G下降甚至倒置。經有效治療后，隨著肝細胞的再生，蛋白質合成功能得到恢復。
2.2.1 治療前后各組ALT、A、G及A/G測定結果（見表1）。表1 血清ALT、A/G變化情況表1顯示：與正常對照組比較，模型組ALT顯著升高（P<0. 001）,A/G比值顯著低于正常組（P<0. 05）。而高低劑量治療組ALT均低于模型組（0. 01
中藥復方對免疫損傷性肝纖維化大鼠肝損害的療效觀察
