甲肝:肝癌治療
在肝癌患者，回輸用腫瘤抗原沖擊致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞觀察到了腫瘤的客觀緩解，針對(duì)肝癌的動(dòng)物學(xué)試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，AFP致敏的DC疫苗不僅能夠抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且對(duì)肝細(xì)胞的再生沒(méi)有影響[28]。GrimmCF等[29]在小鼠肝癌模型應(yīng)用AFP-DNA疫苗誘導(dǎo)出特異性的CTL，能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)，并且對(duì)正常肝細(xì)胞無(wú)損傷。
2）樹(shù)突狀細(xì)胞 樹(shù)突狀細(xì)胞（DendriticCell，DC）是體內(nèi)專職抗原提呈細(xì)胞，20世紀(jì)70年代初Stinman和Cohn首次報(bào)道[17]。DC在T細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[18]，除攝取、加工、呈遞特異性抗原外，DC是唯一能刺激初始（Na?ve）T細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)初次免疫應(yīng)答的APC，具有啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答和誘導(dǎo)免疫耐受的雙重功能。90年代后，DC體外培養(yǎng)獲得成功，使其逐漸成為免疫學(xué)和腫瘤生物治療研究熱點(diǎn)。
細(xì)胞因子激活的殺傷細(xì)胞(Cytokines-inducedkillercells)，為使用多種細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN、TNF和GM-CSF等誘導(dǎo)的具有更強(qiáng)殺傷活性的淋巴細(xì)胞。CIK細(xì)胞是一類非主要組織相容性復(fù)合物和非T細(xì)胞受體限制性的免疫活性細(xì)胞，其主要效應(yīng)細(xì)胞為CD3+、CD56+T淋巴細(xì)胞。由于多種細(xì)胞因子之間的協(xié)同作用，使激活的殺傷細(xì)胞出現(xiàn)更好的增殖及殺傷活性。CIK細(xì)胞可應(yīng)用于肝癌等多種實(shí)體瘤的治療[13-16]。
肝癌治療法一、基因治療 肝癌的發(fā)生和發(fā)展與癌基因的激活和/或抑癌基因的失活有關(guān)，因此最理想治療方式為基因治療，主要包：
細(xì)胞因子基因治療的發(fā)展趨勢(shì)是聯(lián)合基因治療和組織靶向性表達(dá)。聯(lián)合基因治療有助于細(xì)胞因子間發(fā)揮相互協(xié)同的生物學(xué)作用，提高基因治療效果。IL-2和IFN-a的聯(lián)合使用的治療已經(jīng)進(jìn)入II期臨床，療效確切，副作用不大。
利用肝癌特異性單克隆抗體，將放射性同位素、抗腫瘤藥物、免疫毒素等“彈頭”與其連接，特異性提高肝癌局部的藥物濃度，期望提高治療效果。目前131I-鐵蛋白抗體和131I-抗人肝癌單克隆抗體己用于肝癌臨床治療。有報(bào)道：該方法與肝動(dòng)脈結(jié)扎聯(lián)合應(yīng)用，能明顯縮小肝癌體積，創(chuàng)造手術(shù)切除機(jī)會(huì)，提高和延長(zhǎng)肝癌患者生存期。由于McAb具有滲透性差、免疫原性強(qiáng)等缺點(diǎn)，導(dǎo)向作用往往被削弱。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)已研制出基因工程抗體，如抗體的人源化改造、單鏈抗體等，可望克服上述缺點(diǎn)。
1、自殺性基因療法： 自殺基因又稱病毒介導(dǎo)的酶前體藥物治療(VDEPT)，是將藥物治療與基因治療技術(shù)相結(jié)合的一種治療方法。目前用于肝癌基因治療的自殺基因有：?jiǎn)渭儼捳畈《拘叵汆奏ぜっ?HSV-TK)基因/GVC系統(tǒng)、胞嘧啶脫氨酶(CD)基因/5-FC系統(tǒng)、嘌呤核昔酸磷酸酶(PNP)基因/氟達(dá)拉濱系統(tǒng)等。
細(xì)胞，直接造成腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子的高表達(dá)，吸引多種免疫細(xì)胞大量浸潤(rùn)并激活其功能，增強(qiáng)對(duì)肝癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答，有效激活腫瘤特異性免疫反應(yīng)。由于轉(zhuǎn)導(dǎo)或未轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的腫瘤細(xì)胞具有相同的腫瘤抗原，其激發(fā)的特異性免疫反應(yīng)不僅殺傷已導(dǎo)入細(xì)胞因子基因的腫瘤細(xì)胞，而且對(duì)未轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的親代腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性的殺傷，從而治愈腫瘤[6-9]?！?/p>
研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者DC共刺激分子表達(dá)低、IL-12分泌低、刺激T細(xì)胞增殖能力弱、壽命短，攝取抗原能力也較正常人DC弱。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)荷瘤宿主DC功能，從而誘發(fā)或增強(qiáng)宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)，成為腫瘤特異性免疫治療的重要措施。通過(guò)修飾改造患者APC，使其攜帶腫瘤特異性抗原活化初始T細(xì)胞，產(chǎn)生特異性抗腫瘤效應(yīng)的DC疫苗，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中已取到較好的效果[19]。Mule等[20]以黑素瘤細(xì)胞溶解物致敏DC免疫患者，產(chǎn)生特異性T細(xì)胞應(yīng)答。黑色素瘤合成肽DC疫苗II期臨床試驗(yàn)也已在匹斯堡腫瘤研究所完成[21]。治療后，28例患者中2例所有檢測(cè)指標(biāo)均轉(zhuǎn)陰；1例50%的指標(biāo)下降，并持續(xù)2年。此外，在腎癌[22]、胃腸道腫瘤[23]等的治療中也取得一定療效。進(jìn)一步隨機(jī)臨床試驗(yàn)報(bào)告證實(shí)用腫瘤細(xì)胞裂解物或射線滅活腫瘤細(xì)胞進(jìn)行治療的腫瘤患者的總生存期和復(fù)發(fā)生存期均有所改善[24-227]。
2、免疫調(diào)節(jié)基因 肝癌患者存在免功能低下，因此可通過(guò)導(dǎo)入相關(guān)免疫調(diào)節(jié)基因，達(dá)到提高宿主免疫力和治療作用。使用最為普遍為細(xì)胞因子基因治療。目前應(yīng)用于肝癌基因治療的細(xì)胞因子基因有IL-2、IL-12、IFN、TNF和GM-CSF等。根據(jù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的不同，細(xì)胞因子基因治療可分為2種，一種為將細(xì)胞因子基因?qū)朊庖呋钚约?xì)胞，如LAK細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等，增強(qiáng)其功能，達(dá)到提高抗腫瘤免疫的作用。同時(shí)LAK等免疫活性細(xì)胞具有向腫瘤灶趨化的功能，可使腫瘤灶細(xì)胞因子局部濃度提高，更有效地激活腫瘤局部及周圍的抗腫瘤免疫效應(yīng)。另一種為細(xì)胞因子基因?qū)敫伟?/p>
我國(guó)為肝癌高發(fā)地區(qū)，發(fā)病具有明顯特征，約90%具有病毒性肝炎背景，肝炎病毒的感染和復(fù)制與肝癌的發(fā)生和進(jìn)展明顯相關(guān)。雖然早期亞臨床肝癌手術(shù)切除治療效果較好，但是多數(shù)患者就診時(shí)腫瘤已進(jìn)展至晚期，有效治療方法不多。肝癌患者中約80%可見(jiàn)AFP陽(yáng)性，50%患者肝癌組織中P53高表達(dá)，60%患者可檢測(cè)到病毒性肝炎抗原，為肝癌的生物治療提供了良好的靶向。目前肝癌生物治療主要集中在基因治療，免疫治療。
CD基因編碼胞嘧啶脫氨酶可將進(jìn)入肝癌細(xì)胞中的5-氟胞嘧啶（5-FC）轉(zhuǎn)化為5-FU殺死肝癌細(xì)胞。Gaveui等[2]經(jīng)肝被膜下和門(mén)靜脈注射，用CD基因轉(zhuǎn)染和5-FC治療鼠肝癌模型，96％的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝癌體積縮小。CD基因還可通過(guò)誘導(dǎo)及增強(qiáng)宿主的免疫系統(tǒng)功能，活化淋巴細(xì)胞，促進(jìn)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞在腫瘤局部浸潤(rùn)，提高機(jī)體對(duì)肝癌免疫監(jiān)視和免疫清除功能，抑制肝癌的發(fā)生、發(fā)展。Krohne等[3]用PNP/氟達(dá)拉濱系統(tǒng)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2和Hep3B，結(jié)果HepG2和Hep3B肝癌細(xì)胞株死亡。
單純疤疹病毒(HSV)載體攜帶胸腺嘧啶激酶基因(TK)，進(jìn)入肝臟腫瘤細(xì)胞并表達(dá)HSV-TK基因，使丙氧鳥(niǎo)苷三磷酸化，抑制肝癌細(xì)胞DNA聚合酶活性，或代替dTP摻入到細(xì)胞DNA中，使肝癌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成受到抑制，肝癌細(xì)胞死亡。此外HSV-TK-GCV系統(tǒng)還可通過(guò)旁觀者效應(yīng)殺傷肝癌細(xì)胞，不僅轉(zhuǎn)染了HSV-TK基因的肝癌細(xì)胞大量死亡，而且周圍未經(jīng)轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞亦有明顯的死亡。HSV-TK-GCV系統(tǒng)還可通過(guò)誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)，使肝癌組織周圍CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞大量浸潤(rùn)，抑制肝癌細(xì)胞增殖。目前實(shí)驗(yàn)研究表明HSV-TK-GCV系統(tǒng)抗肝癌作用確切，已進(jìn)入臨床I期試驗(yàn)[1]。
我們根據(jù)原發(fā)性HBV感染的肝癌表達(dá)病毒抗原HBsAg的特點(diǎn)，以HBsAg作為靶點(diǎn)，采用HBsAg基因脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的未成熟單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞，能夠誘導(dǎo)特異性的CTL，能夠表達(dá)乙型肝炎表面抗原。CTL對(duì)表達(dá)HBsAg的肝癌細(xì)胞HepG2.2.15有較強(qiáng)的殺傷作用，MTT法檢測(cè)顯示細(xì)胞毒性作用明顯增強(qiáng)（P<0.01)。對(duì)于原發(fā)性HBV感染肝癌的免疫治療，DC疫苗有望成為表達(dá)HBsAg肝癌的一種免疫治療手段?！ ∧[瘤免疫治療的關(guān)鍵是如何找到腫瘤特異的排斥抗原，近年來(lái)外來(lái)體（exosome）作為一種嶄新的腫瘤抗原的來(lái)源，逐漸成為非細(xì)胞性腫瘤疫苗研究的熱點(diǎn)。有學(xué)者證明腫瘤細(xì)胞本身也可以產(chǎn)生外來(lái)體，當(dāng)將這些外來(lái)體負(fù)載到人樹(shù)突狀細(xì)胞的時(shí)候，可以誘導(dǎo)出T細(xì)胞免疫應(yīng)答。而且來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的外來(lái)體含有共有腫瘤排斥抗原（sharedtumorrejectedantigen）[30]，極大地?cái)U(kuò)展了外來(lái)體作為腫瘤疫苗的可能性。
肝癌治療法二、免疫治療 1、單克隆抗體和細(xì)胞因子 八十年代，伴隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多細(xì)胞因子的基因被克隆，并且運(yùn)用基因重組技術(shù)在原核或真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，使那些在生理?xiàng)l件下難以分離的細(xì)胞因子和抗體得以大量生產(chǎn)，特異性免疫治療。臨床上—般多用于肝癌綜合治療，可單獨(dú)或與免疫活性細(xì)胞以及肝癌疫苗聯(lián)合使用。
腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（TIL），為采集腫瘤組織間浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，體外培養(yǎng)擴(kuò)增而成。Schonoclonf等[10]作TIL的細(xì)胞表型分析，提示大多為成熟的CD3+細(xì)胞，其百分比在80％以上，TIL的NK細(xì)胞比率均較低，為5％左右，而LAK細(xì)胞中的NK細(xì)胞比例為10％左右，說(shuō)明LAK細(xì)胞與TIL細(xì)胞在抗腫瘤作用中有不同的殺傷機(jī)制參與結(jié)果。TIL的殺傷效率高于LAK，wallace[11]在體內(nèi)示蹤TIL與LAK細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)腫瘤部位的活性細(xì)胞數(shù)達(dá)到一定數(shù)量后才能顯示其治療效果，TIL回輸后主要積聚在肝臟，提示了TIL在肝癌治療中的進(jìn)一步應(yīng)用的有利因素[12]。
2、細(xì)胞免疫治療： 1）LAK細(xì)胞、TIL細(xì)胞和CIK細(xì)胞 淋巴細(xì)胞因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK），為IL-2在體外活化和擴(kuò)增的淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的殺傷活性，殺傷瘤譜較廣，而且不損傷正常的淋巴細(xì)胞，稱為淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞。經(jīng)IL-2激活后的效應(yīng)LAK細(xì)胞在體內(nèi)外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的溶解放應(yīng)，通過(guò)對(duì)LAK細(xì)胞活性的觀察，可以推測(cè)機(jī)體腫瘤免疫的狀態(tài)，同時(shí)對(duì)指導(dǎo)臨床免疫有重要意義[]。臨床研究中應(yīng)用體外活化和擴(kuò)增的LAK輸入病人體內(nèi)的過(guò)繼免疫治療，對(duì)黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、淋巴瘤等有一定療效。
肝癌的生物治療 腫瘤生物治療技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，得到迅速發(fā)展，已成為有別于傳統(tǒng)治療方式的一種極具希望的抗腫瘤治療手段。
近年來(lái)在自殺基因系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，提倡合并使用其他抗肝癌生物治療方法，如聯(lián)合使用細(xì)胞因子，可促進(jìn)CTL細(xì)胞及NK細(xì)胞增殖，細(xì)胞毒作用增加。Kim等[4]聯(lián)合應(yīng)用CD/5-FC和IL-18轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株，結(jié)果肝癌周圍可見(jiàn)大量CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肝腫瘤體積明顯縮小，明顯優(yōu)于單用CD/5-FC組或IL-18組。Kwang等[5]將IL-2與HSV-TK基因聯(lián)合應(yīng)用于活體治療肺癌肝轉(zhuǎn)移，結(jié)果肝腫瘤完全消退。
我們應(yīng)用肝癌細(xì)胞HepG2凍融抗原致敏DC（Hep-DC），與自體淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后，進(jìn)行體外殺傷試驗(yàn)。結(jié)果顯示Hep-DC-L對(duì)HepG2具有較強(qiáng)的殺傷作用，明顯高于未致敏DC刺激的淋巴細(xì)胞（DC-L）和單純淋巴細(xì)胞（L）（P<0.05），提示HepG2凍融抗原致敏的DC可誘導(dǎo)自體淋巴細(xì)胞產(chǎn)生HepG2抗原特異性CTL，對(duì)HepG2發(fā)揮高效特異的殺傷作用?！ ≡诖嘶A(chǔ)上，我們應(yīng)用AFP-cDNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染DC制備AFP-DC瘤苗，電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)培養(yǎng)上清中含有AFP抗原分子，證實(shí)AFP-DC能夠表達(dá)并分泌AFP，同時(shí)，細(xì)胞免疫熒光染色可見(jiàn)細(xì)胞膜及胞漿熒光染色陽(yáng)性，表明AFP-DC不僅能夠表達(dá)AFP，并且能夠?qū)FP抗原分子提呈到細(xì)胞膜上。AFP-DC活化的CTL對(duì)表達(dá)AFP的肝癌細(xì)胞株HepG2有強(qiáng)的殺傷作用，與對(duì)照組相比，差異顯著，表明AFP-DC活化的CTL是AFP特異性的。證實(shí)肝癌相關(guān)性抗原AFP可作為肝癌靶向治療的突破點(diǎn)，AFP-DC疫苗可以成功誘導(dǎo)出AFP特異性CTL，對(duì)表達(dá)AFP的肝癌細(xì)胞株HepG2具有特異性殺傷效用。
我們以健康供者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBSC）為來(lái)源，在GM-CSF、TNF-a和IL-4作用下體外誘導(dǎo)培養(yǎng)出具有典型形態(tài)特征和表型的DC，誘導(dǎo)的DC光鏡和掃描電鏡下細(xì)胞周圍可見(jiàn)毛刺狀突起和樹(shù)枝狀突起，透射電鏡下細(xì)胞表面不規(guī)則，可見(jiàn)各級(jí)突起，胞內(nèi)可見(jiàn)溶酶體、線粒體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)；DC特征性表型CD1a、CD11c表達(dá)量分別為47.7%、78.49%，MHC分子HLA-DR和共刺激分子CD80、CD86表達(dá)量分別為66.09%、51.37%、55.83%。
我們采用基因重組技術(shù)構(gòu)建了用乙肝病毒表面抗原“a”位點(diǎn)基因替換CD74分子的CLIP片段基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，希望通過(guò)恒定鏈分子的引導(dǎo)肽將該抗原引導(dǎo)到MVB中，從而進(jìn)入外來(lái)體的形成通路，最終將目的抗原負(fù)載到外來(lái)體。同時(shí)我們利用外來(lái)體的直徑是50~90nm的物理特性，采用用基于孔徑的生物膜分離技術(shù)成功地制備了外來(lái)體。希望能采用外來(lái)體提取肝癌等腫瘤抗原，解決肝癌生物治療中特異性腫瘤抗原來(lái)源困難的問(wèn)題 生物肝癌治療法日新月異，隨著現(xiàn)代基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步，新的治療方法和手段層出不窮，我們相信其治療效果將會(huì)得到極大改善，在臨床應(yīng)用中挽救更多的生命。
